0学时 2学分 春季学期(3-6月)
主讲教师： 李旭、王冬梅
上课地点： 生物楼363室
 

实验内容 高级生化与分子生物学实验教学以研究生的实验室实践为主,力求发挥其主体作用；教师只作必要的实验原理和注意事项的讲解,并注意引导学生结合实际工作需要拓展所学内容。完成本实验学习内容后，要求学生掌握生化与分子生物学关键实验流程及各主要技术手段，提高其实践能力和创新能力。

目的基因的获取及重组质粒构建：
1、PCR引物设计——掌握PCR引物设计原理及设计流程，在授课教师指导下完成实验所需目的DNA的引物设计及优化
2、目的基因克隆、酶切、连接——掌握质粒DNA提取、聚合酶链反应（PCR）、目的基因与质粒的限制性内切酶消化、目的基因与质粒DNA的连接等实验操作技巧
3、重组体鉴定（酶切、PCR）——通过限制性内切酶消化及PCR方法结合核算电泳鉴定前述步骤中构建的重组质粒

重组菌株表达条件优化：
1、重组质粒转化——学习感受态细胞制备原理，掌握质粒DNA的转化和筛选
2、高产重组菌株筛选（保种）——通过小量菌体培养诱导，结合蛋白质电泳筛选高产重组菌株，同时掌握菌株的低温保藏
3、表达条件优化（蛋白质电泳）——掌握促使异源蛋白可溶性重组表达的常规摸索方法，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

生化实验涵盖范畴：
1、分子筛的灌装、柱效测定及分子量标定——通过学习凝胶层析法的基本原理，掌握分子筛凝胶的特性、如何灌装高柱效层析柱
2、硫酸铵沉淀法梯度分离蛋白质——学习盐析生物学方法分离纯化蛋白质，特别是对原料的初步分离
3、四种方法平行测定蛋白质相对浓度——掌握不同的蛋白质含量测定方法
4、Crosslink方法确定蛋白质聚集特性——学会巧妙运用交联剂（辛二酸二琥珀酰亚胺 (DSS，Disuccinimidyl suberate)）突破蛋白质结构、蛋白质间相互作用、细胞膜结构等研究。

pEGFP-N3阳性结果图 张士杰 陈川                    pDsRed1N1阳性对照图 刘源 胡婷婷